Микроскопы предназначены для получения увеличенных изображений объектов и изучения объектов либо их деталей, которые невозможно рассмотреть невооруженным глазом.
В зависимости от класса и конструкции прибора он может обеспечить увеличение в десятки или тысячи раз:
40-кратное увеличение позволяет комфортно изучать объекты с размерами 5 мм;
100-кратное — с размерами 2 мм;
400-кратное — с размерами 0,45 мм;
1000-кратное — с размерами 0,18 мм.
Если говорить о полезном видимом увеличении, при котором разрешающая способность микроскопа соответствует разрешающей способности глаза, такой параметр для светового (оптического) микроскопа составляет 1500-2000 раз. Это позволяет рассмотреть клетку и ее органеллы, а также различные поверхности (например, ткань) для обнаружения дефектов на них.
У микроскопов малого увеличения эта характеристика составляет до 400×, у приборов большого увеличения — превышает 400× (иногда выделяют линейку приборов среднего увеличения — в диапазоне 400-1000×).
Школьные (ученические) микроскопы и прямые микроскопы начального уровня
Оптические микроскопы — самые бюджетные и простые в исполнении устройства, хотя изготовление приборов большого увеличения требует высокого качества применяемых материалов и компонентов, поэтому такие приборы стоят недешево, но и их возможности существенно расширены, особенно с применением различных аксессуаров.
К этому типу относятся школьные (ученические) микроскопы
Сюда можно отнести и прямые микроскопы начального уровня
Конструкция оптического микроскопа включает:
стойку с закрепленными на ней объективом;
окуляром;
осветительной системой;
предметным столиком.
Оптическая система объектива состоит из нескольких расположенных последовательно в трубке стеклянных линз, каждая из которых увеличивает изображение, полученное с поверхности предыдущей. У каждой линзы свое фокусное расстояние, и в тубусе объектива они закреплены без возможности перемещения.
По качеству изображения объективы бывают:
ахроматическими (для работы в спектральном диапазоне 486-656 нм с исправлением сферической, хроматической, коматической, частично сферохроматической аберраций для двух длин волн, а также с корректировкой астигматизма;
апохроматическими (работают в расширенной спектральной области, ахроматизация предусмотрена для трех длин волн, исправляют также вторичный спектр и сферохроматическую аберрацию; в сравнении с ахроматами имеют выше числовую апертуру и характеризуются четким изображением и точной цветопередачей);
полуапохроматами или микрофлюарами — с промежуточным качеством изображения;
плоского поля (планами), в которых скорректирована кривизна изображения по полю. Это делает изображение объекта равномерно резким, что удобно при фотографировании.
Микроскопы начального класса комплектуются экономичными ахростигматическими, СР-ахроматическими, стигмахроматическими объективами или ахропланами.
Существуют классификации объективов :
по длине тубуса (с конечной длиной или скорректированные на длину «бесконечность»);
числовой апертуре и методу ее изменения;
рабочему расстоянию (свободному расстоянию между объектом и нижним краем оправы или линзы фронтальной части объектива);
по обеспечению методов исследования и контрастирования: работающие с покровным стеклом и без него;
объективы проходящего и отраженного света, люминесцентные, поляризационные, фазовые, DIC (работают по методу дифференциально-интерференционного контраста);
объективы отраженного света для работы методами светлого и темного поля (эпиобъективы);
иммерсионные и безыммерсионные.
Иммерсия — это введение в пространство между объектом наблюдения и специализированным объективом жидкости — масла, воды, силикона или глицерина. Так повышается разрешающая способность микроскопа за счет увеличения разности показателя преломления среды и объекта. Увеличивается и глубина слоя, который можно просмотреть, а количество рассеянного света снижается.
Маркировка объектива отображает его увеличение («х» = раз: 8×, 40×, 90×), числовую апертуру: 0,20; 0,65 и т.д., например 40/0,65 или 40×/0,65.
После этих числовых значений у иммерсионных объективов указывают тип инверсии: Oil (масляная), W (вода), S (силикон) и т.д.
Дополнительная буквенная маркировка относится к методам исследования и контрастирования, для которых может быть задействован объектив: Ф — фазовый, П (Pol) — поляризационный, Л (L) — люминесцентный, ФЛ (PhL) — фазово-люминесцентный, ЭПИ (Epi, HD) — эпиобъектив для работы в отраженном свете по методу темного поля, ДИК (DIC) — дифференциально-интерференционный контраст, например 8×/0,20 Ф (Ph2 8×/0,20). Маркируют также тип оптической коррекции: АПО (АРО) — апохромат, ПЛАН (PL, Plan) — планахромат, ПЛАН-АПО (Plan-Аро) — планапохромат, СХ — стигмахромат (Achrostigmat, CP-achromat, Achroplan), микрофлюар (полуплан-полуапохромат) — СФ или М-ФЛЮАР (MICROFLUAR, NEOFLUAR, NPL, FLUOTAR) (улучшенный ахромат, полуплан). Кроме того, маркировка содержит тубусное расстояние, корректировку на покровное стекло и рабочее расстояние объектива.
Общее увеличение микроскопа — это кратность окуляра, умноженная на кратность объектива: если кратность окуляра 10×, а объектива — 15×, то общее увеличение составит 150×.
Оптический микроскоп, как правило, снабжен несколькими объективами с разной степенью увеличения, закрепленными на стойке (револьверной насадке, турели). Это позволяет рассмотреть объект с различным увеличением, передвинув нужный объектив
в рабочее положение. В моделях микроскопов начального уровня таких сменных объективов обычно не более четырех, а простейшие оснащены одним объективом, но с возможностью замены окуляров. В профессиональных моделях количество объективов в турели больше (доходит до восьми), а их характеристики совершеннее.
Окуляр — часть оптической системы, обращенная к пользователю: приложив к окуляру глаз, пользователь видит увеличенное объективом изображение. Линзы окуляра позволяют отрегулировать четкость увеличенного изображения для правильного восприятия глазом человека в зависимости от особенностей его зрения.
Бинокулярная насадка позволяет наблюдать за объектом двумя глазами, что удобнее для исследователя и менее утомительно для зрения.
Тринокулярная насадка имеет дополнительное гнездо для подключения цифровой камеры или цифрового окуляра, относящихся к системам видеодокументирования
Плюсом того и другого устройства будет возможность регулировки межзрачкового расстояния, чтобы пользователям с разными физиологическими параметрами было удобно работать с прибором.
Осветительная система нужна для подсветки изучаемого объекта, так как путь естественного света к нему перекрыт объективом. Простейшая осветительная система реализована в виде зеркала, принимающего лучи от внешнего источника и направляющего их на рассматриваемый объект. Кроме того, в качестве подсвечивающего устройства могут использоваться лампы различной конструкции или светодиоды.
Стереомикроскопы
Доступны также стереомикроскопы
Прямые исследовательские микроскопы
Прямые исследовательские
Конструкция этих приборов включает конденсор, размещенный между источником света и предметным столиком и представляющий собой линзу или систему линз, собирающую световой луч от источника и направляющую этот луч на объект исследования. Это повышает разрешение изображения и дает возможность регулировать его по равномерности освещения в проходящем свете, контрастности и глубине резкости. В приборах профессионального уровня обычно используются съемные подвижные конденсоры большой апертуры и ирисовая диафрагма, позволяющая плавно регулировать интенсивность освещения. При выборе такого микроскопа нужно уточнить характеристики и тип конденсора в зависимости от применяемых методов наблюдения: светлого и темного поля, фазового контраста, интерференционного контраста или флуоресценции.
Специальная оптика позволяет рассмотреть образцы не только в видимой части спектра, но и в ближней ИК области.
На предметный столик с закрепленным на нем объектом изучения направлен объектив. Поверхность столика должна быть плоской для удобства фиксирования объекта. Удобнее работать с подвижным столиком, который управляется микрометрическими винтами: двигать руками предметное стекло на неподвижном столике крайне неудобно, особенно при большом увеличении.
Инвертированные микроскопы
В инвертированном
микроскопе источник света с конденсором размещаются в верхней части прибора — над предметным столиком, а объектив размещен под последним и направлен вверх. Направление хода лучей изменяется системой зеркал, так что наблюдатель может рассмотреть объект, как обычно (сверху вниз). Это удобно при исследовании громоздких объектов в технических отраслях (например, металлургии), а в биологии и медицине такой прием позволяет изучать ткани и клеточные культуры: на предметный столик можно поместить объект в чашке Петри или колбе.
Толщина объекта для инвертированных микроскопов не имеет ограничения, в отличие от прямых микроскопов плоского поля (в которых она ограничена рабочим расстоянием объектива).
Развитие различных техник микроскопии привело к созданию специализированных систем.
Поляризационные микроскопы
Поляризационный микроскоп
Такие исследования востребованы в минералогии, кристаллографии, материаловедении, а также в криминалистике, медицине и биологии.
Конфокальные микроскопы
В конфокальных микроскопах
Диафрагма расположена после линзы объектива так, чтобы через нее проходил только свет от исследуемой точки. Остальные лучи задерживаются.
Так можно проводить трехмерное субмикронное неразрушающее исследование прозрачных образцов.
Разрешающая способность в таких микроскопах повышается за счет использования в качестве источников света лазеров, которые монохроматичны и обеспечивают высокую параллельность светового пучка, и это отличает их от ртутных либо ксеноновых ламп в традиционной оптической микроскопии. Это снижает количество бликов и повышает точность фокусировки.
Лазер сфокусирован в определенной точке и освещает только ее, конфокальная диафрагма устраняет внефокусную флуоресценцию, а изменяя ее диаметр исследователь устанавливает толщину оптического слоя возле фокуса лазерного луча. Таким образом улучшается разрешение по оси Z.
Этот метод позволяет исследовать не только внутреннюю структуру флуоресцентно меченных клеток, но даже идентифицировать их отдельные молекулы и структуры (в том числе гены), а также наблюдать за протеканием внутриклеточных динамических процессов. Задействовав многоцветное флуоресцентное окрашивание биологически активных молекул и надмолекулярных комплексов, можно изучать даже целые системы, а не отдельные клетки.
Электронные микроскопы дают увеличение в 200000 раз, но такие приборы требуют создания особых условий эксплуатации. Промежуточное значение между оптическими и электронными занимают рентгеновские микроскопы, обеспечивающие увеличение на уровне 100000×. Их теоретическая разрешающая способность составляет 2-20 нм (у световых — до 150). Такие приборы применяют для изучения объектов с размерами, сопоставимыми с длиной рентгеновской волны.
Сканирующие зондовые микроскопы
Наиболее чувствительные сканирующие зондовые микроскопы
Это дает очень точное трехмерное изображение поверхности объекта. Сигналы с чувствительных сенсоров зонда, управляемого системой перемещения, регистрируются специализированным устройством, а затем на основе полученных данных программным путем создается топографическая картина объекта. Разработаны также зонды, функционирующие по оптическому принципу.
Такие приборы позволяют получить трехмерное изображение различных объектов (от атомных решеток до целых микросхем, а также биомолекул и клеток) с высоким (в некоторых моделях на уровне 0,1-0,2 нм) разрешением, что открывает широкие возможности применения сканирующей зондовой микроскопии в различных отраслях деятельности.
