Видео. Системы препаративного электрофореза BluePippin и Pippin Prep, Sage Science, англ., 2012 г.

Система препаративного электрофореза для разделения и выделения только фрагментов ДНК размером от 50 до 8000 п.о.; детекция фракций осуществляется без использования УФ, что гарантирует отсутствие повреждения фрагментов.

Технические характеристики:

Принцип работы:

В системе используются готовые кассеты на пять изолированных капилляров, заполненных агарозным гелем. В конце каждого капилляра есть Y-образное разветвление. Оба выходящих капилляра имеют независимое подключение к катодам. Движение фрагментов ДНК в капилляре как и в «классической» методике происходит под действием тока, но при приближении фрагментов ДНК требуемого размера к месту разветвления, происходит переключение катодов, и искомый фрагмент попадает в боковое ответвление капилляра и собирается в канале для сборки.

Преимущества метода:

• за один сеанс система может работать параллельно с 4 образцами + 1 внешний стандарт или с 5 образцами при использовании внутреннего стандарта; время подготовки - 3 минуты, время проведения самой процедуры – 50-100 мин в зависимости от размеров фрагментов;
• благодаря готовым гелевым чипам достигается максимальная воспроизводимость экстракции и, как следствие, более точный результат секвенирования;
• каналы, в которых идёт разгонка, полностью изолированы друг от друга, что снижает риск перекрёстной контаминации;
• отбор осуществляется, автоматически в соответствии с заданным через ПО диапазоном длин фрагментов, что может использоваться для секвенирования спаренных концов.

Области применения:

• приготовление библиотек при проведении NGS;
• подготовка образцов для парноконцевого секвенирования, ChIP-секвенирования;
• улучшение библиотек при проведении эмульсионной ПЦР;
• выделение белков и НК.

Характеристики картриджей:

• Одновременный прогон до 5 образцов;
• напряжение при электрофорезе, В — 25, 100 и 150 (постоянный ток), или 100 в режиме пульс-электрофореза;
• ток (на каждую дорожку), мА — 2 или 3;
• длина волны возбуждения, нм — 470;
• длина детекции, нм — 525;
• максимальная нагрузка фрагментированной геномной ДНК на дорожку, мкг — 5;
• минимальная нагрузка фрагментированной геномной ДНК на дорожку, нг — 15;
• размер ДНК - 100 bp - 50 kb;
• точность выделения, % - > 93;
• воспроизводимость выделения, % - > 92;
• минимальное распределение по размерам, % - 8;
• выход образца, % - 50-80;
• габариты, ШхГхВ, см — 28х53х18;
• вес, кг — 7.

Области применения:

• приготовление библиотек при проведении NGS на секвенаторах ДНК HiScan SQ, HiSeq 2000, MiSeq (Illumina);
  5500 xl W, 5500w, Ion Torrent IonProton, Ion Torrent PGM (Life Technologies);
  GS FLX+, GS Junior (Roche);
• подготовка образов для парноконцевого секвенирования, ChIP-секвенирования;
• улучшение библиотек при проведении эмульсионной ПЦР с помощью систем QX100 и QX200 с автоматической системой генерации капель (Bio-Rad);
• выделение НК и белков.

Принцип работы: в системе используются готовые картриджи на пять изолированных капилляров, заполненных агарозным гелем разной процентной концентрации, которая выбирается пользователем в зависимости от величины фрагмента образца. В конце каждого капилляра имеется Y-образное разветвление. Оба выходящих капилляра имеют независимое подключение к катодам. Движение фрагментов ДНК в капилляре как и в «классической» методике происходит под действием тока, но при приближении фрагментов ДНК требуемого размера к месту разветвления, происходит переключение катодов, и искомый фрагмент попадает в боковое ответвление капилляра и собирается в канале для сборки. Для проведения электрофореза нуклеиновых кислот используется Tris-TAPS (или Трис-ТАПС) буфер, для белков — SDS-буфер. Программное обеспечение определяет время элюирования на основе миграции ДНК-маркера.

4 режима программирования:

1. Tight (узкий) – сбор коротких фрагментов образца, выбирается в основном для работы с молекулами небольших размеров.
2. Range (диапазон) – пользователь может сам выбрать диапазон размера фракций который ему необходим. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.
3. Time (время) – коллекционирование образцов происходит в зависимости от заданного времени. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.
4. Peak (пик) – сбор пиков (нескольких фрагментов разного размера).

3 стратегии детектирования фракций:

• Для ДНК малых размеров (90 п.н. -1,5 тыс.п.н.):
  Стратегия без окрашивания с внутренними флуоресцентно-мечеными маркерами. В качестве внутренних стандартов используются флуоресцентно-меченые маркеры ДНК, определенной молекулярной массы. Добавляются в лунку совместно с исследуемым образцом. Одновременно возможен анализ 5 образцов.
• Для ДНК больших размеров (> 2 тыс. п.н.):
  Стратегия без окрашивания с внешним флуоресцентно-меченым маркером. В качестве внешнего стандарта используется флуоресцентно-меченый маркер ДНК определённой молекулярной массы, добавляется в отдельную лунку. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.
• Для выделения ДНК с дорожки (band capture) (> 2 тыс. п.н.):
  Окрашивание образцов флуоресцентным красителем Midori Green. Образцы окрашиваются флуоресцентным красителем Midori Green. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.

Преимущества метода:

• Время подготовки — 3 минуты, время проведения самой процедуры — 50-100 мин в зависимости от размеров фрагментов.
• Благодаря готовым гелевым чипам достигается максимальная воспроизводимость экстракции и, как следствие, более точный результат секвенирования.
• Каналы, в которых идёт разгонка, полностью изолированы друг от друга, что снижает риск перекрёстной контаминации.
• Отбор осуществляется, автоматически в соответствии с заданным через ПО диапазоном длин фрагментов, что может использоваться для секвенирования спаренных концов.
• Отбор образцов из пробоотборной камеры производится вручную с помощью стандартного дозатора.

Схема работы:

1. Пробоподготовка:
• Подготовка материала, если используются внутренние стандарты: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл флуоресцентно - меченного маркера.
• Подготовка материала, если используется внешний стандарт: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл загрузочного раствора. 40 мкл готового стандарта помещается в отдельную дорожку.
• В случае с красителем Midori Green, 40 мкл красителя помещается в каждую из пяти + буферную камеру и при включении тока будет двигаться на встречу образцам.
2. Эксперимент:
• Выбираем картридж в соответствии со стратегией, с помощью которой будет производиться детектирование НК;
• помещаем картридж в прибор и выбираем её в ПО из списка предложенных программой (ПО само установит все необходимые параметры для проведения электрофореза под выбранный картридж);
• По истечении времени, заданного программой, образец аккуратно собираем из коллектора фракций пипеточным дозатором.

Информация о свежих статьях:

1. Nature Methods. Assembly and diploid architecture of an individual human genome via single-molecule technologies (июнь, 2015); Authors: Matthew Pendleton, Robert Sebra, Andy Wing Chun Pang, Ajay Ummat et al.
2. BioTechniques. Optimization and cost-saving in tagmentation-based mate-pair library preparation and sequencing. (май, 2015) DOI:10.1038/nmeth.3454; Authors: Kaori Tatsumi, Osamu Nishimura, Kazu Itomi, Chiharu Tanegashima, and Shigehiro Kuraku.

Видео:
Системы препаративного электрофореза BluePippin и Pippin Prep

Для проведения пульс-электрофореза применяется специальный источник питания Pippin Pulse.