Возможно, вы сменили регион при заполнении корзины.
Часть товаров из корзины будет перемещена в статус отложенных
и не сможет быть оформлена для заказа, если вы продолжите работу в данном регионе
Стратегии подготовки библиотек для нанопорового секвенирования: от протоколов к биологическому смыслу
22.07.2026
Нанопоровое секвенирование стало одним из наиболее динамично развивающихся направлений высокопроизводительного анализа нуклеиновых кислот. Технология обеспечивает прямое считывание длинных молекул ДНК и РНК, что открывает широкие возможности для исследования структурных вариаций генома, эпигенетических модификаций, метагеномных сообществ и полноразмерных транскриптомов. Несмотря на постоянное совершенствование аппаратных платформ и алгоритмов обработки данных, качество получаемых результатов в значительной степени определяется эффективностью подготовки образцов.
Подготовка библиотеки является одним из наиболее критических этапов рабочего процесса нанопорового секвенирования. Именно на этой стадии формируются характеристики будущих данных, включая распределение длин прочтений, полноту покрытия генома, уровень систематических ошибок и эффективность использования пропускной способности секвенатора.
В отличие от технологий коротких прочтений, где фрагментация ДНК является обязательным этапом, нанопоровое секвенирование ориентировано на сохранение максимально длинных молекул. Поэтому основной задачей подготовки образца становится минимизация механических повреждений нуклеиновых кислот и обеспечение высокой химической чистоты образца.
Современные протоколы подготовки библиотек разрабатываются с учетом типа исследуемого материала, целей эксперимента и требований последующего биоинформатического анализа.
Биофизические основы: роль адаптеров и моторного белка
Ключевой этап подготовки любой библиотеки — присоединение к концам нуклеиновых кислот специфических секвенирующих адаптеров. Эти адаптеры не просто служат «якорем» для праймеров; они связаны с моторным ферментом (хеликазой или транслоказой). Именно этот белок выполняет две критически важные функции:
Транслокация — протягивание одиночной цепи полимера через биологическую нанопору.
Молекулярный тормоз — замедление скорости прохождения молекулы до уровня, достаточного для точной регистрации изменений ионного тока.
Прохождение цепи через пору вызывает характерные флуктуации ионного тока, которые оцифровываются и декодируются в последовательность нуклеотидов (сигнал «сырых» данных). Понимание этого механизма критично при выборе протокола: например, методы без ПЦР сохраняют модификации оснований, которые считываются как «особые» паттерны сигнала, тогда как амплификация эту информацию уничтожает.
Принцип нанопорового секвенирования и основные компоненты технологического процесса. Изображение сгенерировано с помощью нейросети Nano Banana.
Базовые требования к исходному материалу
Успех эксперимента определяется качеством препарата нуклеиновых кислот. Для нанопорового секвенирования это означает:
Высокая молекулярная масса. Фрагментация неизбежно снижает длину прочтений, что критично для сборки геномов de novo или анализа повторов.
Химическая чистота. Примеси (фенолы, полисахариды, белки, гуанидин) ингибируют ферменты (лигазы, транспозазы) и блокируют нанопоры, резко снижая пропускную способность.
Контроль качества обязателен на всех этапах: флуориметрия
(Qubit) для точной концентрации, спектрофотометрия (Nanodrop) для оценки белковых загрязнений (соотношение A260/280), и, что особенно важно, электрофорез
(капиллярный или гелевый) для визуализации распределения длин фрагментов.
Стратегии подготовки ДНК-библиотек: выбор между скоростью, длиной и выходом
Все существующие протоколы подготовки библиотек по сути сводятся к лигированию и использованию транспозазной «быстрой» химии.
На примере наборов компании Polyseq, разберем основные стратегии:
Это «золотой стандарт» для проектов, где приоритетом является максимальный выход данных и сохранность длинных фрагментов.
Механизм: ферментативная «починка» концов ДНК (энд-репарация и репарация ников) с последующим присоединением адаптеров с помощью ДНК-лигазы.
Преимущества: максимальная эффективность для высокомолекулярной ДНК, совместимость с кДНК и ампликонами. Отсутствие ПЦР
в базовом протоколе позволяет детектировать эпигенетические модификации (например, метилирование 5mC) без бисульфитной обработки.
Гибкость: позволяет включать этапы фрагментации или сайз-селекции (отбор фрагментов по размеру) по мере необходимости.
Последовательность этапов подготовки библиотеки с использованием протокола лигирования. Изображение сгенерировано с помощью нейросети Nano Banana.
Это решение для быстрой диагностики и полевых условий, где время — критический ресурс.
Механизм: используется фермент транспозаза, которая одновременно фрагментирует нативную ДНК и «пришивает» к концам разорванных цепей транспозазные адаптеры. Секвенирующие адаптеры присоединяются к ним за 10 минут.
Нюансы: идеальный входной материал — высокомолекулярная ДНК, чтобы компенсировать случайную фрагментацию. Этот метод особенно хорош для плазмидной ДНК, так как транспозаза эффективно «разрезает» кольцевые структуры, избавляя от этапа линеаризации.
Последовательность этапов подготовки библиотеки с помощью транспозазной химии. Изображение сгенерировано с помощью нейросети Nano Banana.
Стратегии мультиплексирования: баркодирование без ПЦР и с ПЦР
Для экономии ресурсов платформы критически важно мультиплексирование (до 96 образцов). В зависимости от используемой химии, компания Polyseq предлагает два типа баркодирования, для работы с которыми разработан универсальный Barcoding Library Preparation Kit.
Этот набор включает специализированные адаптеры, совместимые одновременно с двумя системами баркодов — лигазными и транспозазными, что делает его гибридным решением для лабораторий.
Данный набор содержит уникальные баркод-адаптеры, предназначенные для мечения образцов специфичными олигонуклеотидными индексами.
Процесс: в присутствии ДНК-лигазы баркоды ковалентно сшиваются с подготовленными фрагментами ДНК каждого образца. После этого образцы пулируются, и лигированный продукт очищается. Для завершения построения библиотеки используется вышеупомянутый Barcoding Library Preparation Kit, после чего пул готов к секвенированию.
Этот набор содержит транспозазные комплексы с пришитыми баркодами.
Процесс: система позволяет совместить два критических этапа в одной пробирке — случайную фрагментацию ДНК и одновременное присвоение образцу уникальной молекулярной метки.
Скорость: в сочетании с быстрой очисткой на магнитных частицах и присоединением секвенирующих адаптеров, весь процесс мультиплексирования (до 24 образцов) занимает около 60 минут, что делает этот метод предпочтительным для скрининговых исследований и задач клинической экспресс-диагностики.
Преимущество: полное отсутствие амплификации, сохранение нативных модификаций оснований.
Cеквенирование РНК: уникальные возможности
Технология ONT (Oxford Nanopore Technologies) позволяют секвенировать нативную РНК, минуя синтез кДНК. Это важно для изучения истинного транскриптома.
Протокол Direct RNA Sequencing Kit: к одноцепочечной РНК отжигается праймер, и обратная транскриптаза синтезирует цепь кДНК. Однако через пору проходит именно нативная цепь РНК (кДНК выступает в роли «якоря» для стабилизации структуры).
Информативность: позволяет оценить длину поли(А)-хвоста, детектировать модификации РНК (например, m6A) без химической обработки.
Однако чаще всего для высоких выходов данных более востребовано секвенирование кДНК, где после синтеза первой цепи и переключения праймера (с внесением UMI — уникальных молекулярных идентификаторов) следует амплификация, что идеально для глубокого анализа сплайс-вариантов и слитых транскриптов.
Адаптивный семплинг и таргетный анализ
Адаптивный сэмплинг (Adaptive Sampling) по сути является таргетным обогащением в реальном времени. Это программный метод, позволяющий обогащать или истощать определенные регионы генома во время самого процесса секвенирования. В отличие от классических методов (гибридизация с зондами или ПЦР), адаптивный семплинг не требует дополнительных стадий подготовки библиотеки, полностью сохраняет модификации и позволяет работать с цифровыми панелями без физических проб. Это революционный шаг для метагеномики и диагностики, где важно быстро находить патогенные последовательности на фоне хозяйской ДНК.
Схематичное изображение принципа секвенирования с обогащением (adaptive sampling). Изображение взято из статьи Maximizing the potential of genomic and transcriptomic studies by nanopore sequencing, Daria Meyer et al., DOI:10.1101/2023.12.06.570356
Подготовка библиотеки для нанопорового секвенирования — это не рутинный технический шаг, а ключевой дизайнерский этап эксперимента. Рациональное сочетание качества исходного препарата, корректной стратегии подготовки и строгого контроля на каждом этапе обеспечивает получение репрезентативных и воспроизводимых результатов, соответствующих самым высоким стандартам современной молекулярной биологии.
Набор предназначен для подготовки библиотек на платформе PolySeq, является одной из частей набора для создания баркодированных библиотек. Данный набор включает в себя реактивы для стадий лигирования адаптера, последующей очистки готового пула библиотек и непосредственно нанопорового секвенирования. Набор подходит для наборов Transposase-based Barcode Kit (PY-DTB101, PY-DTB102) и Ligase-based Barcoding Kit (PY-DLB101, PY-DLB102). Набор рассчитан на 6 реакций.
Особенности набора
Набор предназначен для подготовки пула из нескольких библиотек (до 24 баркодов) на запуск;
подготовка библиотеки занимает от 2,5-3 часов практического времени.
Состав набора
Компонент
Объем компонента, мкл
Ligation Adapter (LA)
30
Ligation Buffer (LB)
150
DNA Ligase (TDL)
50
DNA Purifying Beads (DPB)
1200
All fragment Washing Buffer (AWB)
1800
Long fragment Washing Buffer (LWB)
1800
Elution Buffer (EB)
500
Sequencing Buffer (SQB)
1800
Anchoring Tether (ACT)
60
DNA Positive Control （100 ng/uL） (DPC)
60
Хранение компонентов набора: ферменты и буферы набора Barcoding Library Preparation kit необходимо хранить при -20 °С. DNA Purifying Beads (DPB) набора могут храниться при температуре от +4 °С до +8 °С.
Набор для баркодирования на основе лигазы содержит 24 различных баркода из PY-DLB101 и PY-DLB102, что позволяет мультиплексировать до 24 образцов ДНК в одном цикле секвенирования. При использовании в сочетании с набором Barcoding Library Preparation kit (PY-BLP101) для подготовки библиотеки, ДНК/ДНК-фрагменты на первом этапе происходит репарация концов и достройка к ним dA-хвостов и лигирование индивидуальных уникальных баркодов, на втором этапе образцы объединятся в единый пул, очищаются вместе и происходит лигирование адаптера секвенирования. Набор рассчитан на 6 реакций.
Особенности набора
Набор предназначен для подготовки пула библиотек на запуск (от 3 до 24);
в качестве входящего материала можно использовать очищенные ПЦР продукты, фрагментированную геномную ДНК (например, ДНК, фрагментированная ферментативным расщеплением или ДНК-фрагменты, полученные механическими методами);
требуемое исходное количество ДНК зависит от количества образцов, которое будет использоваться для запуска, общее количество не должно превышать больше 1 мкг;
подготовка библиотеки занимает 2,5-3 часа практического времени.
Состав набора
Компонент
Объем компонента, мкл
DNA End-repair Buffer (DEB)
42
DNA End-repair Enzyme (DEM)
18
Barcode 1-12/13-24 (LBC)
6 кажлого
Barcode Ligation Mix (BTA)
150
Stopping Buffer (STB)
50
Хранение компонентов набора: ферменты и буферы набора Ligase-based Barcoding Kit Kit необходимо хранить при -20 °C.
Набор содержит 24 различных комплекса транспозазы, промаркированные уникальными бакродами. При использовании в сочетании с набором Barcoding Library Preparation kit (PY-BLP101) для подготовки библиотеки, позволяет одновременно секвенировать до 24 образцов. Набор рассчитан на 6 реакций.
Особенности набора
Набор предназначен для подготовки пула библиотек на запуск (от 3 до 24);
происходит одновременное фрагментирование ДНК транспозазным и комплексом и внесение уникальных баркодов;
в качестве входящего материала можно использовать очищенные ПЦР продукты, фрагментированную геномную ДНК (например, ДНК, фрагментированная ферментативным расщеплением или ДНК-фрагменты, полученные механическими методами);
требуемое исходное количество ДНК зависит от количества образцов, которое будет использоваться для запуска, общее количество не должно превышать больше 1 мкг;
подготовка библиотеки занимает 1,5-2 часа практического времени.
Состав набора
Компонент
Объем компонента, мкл
Enzyme Buffer (TB)
72
Barcode 1-12/13-24 (LBC)
6 кажлого
DNA Purifying Beads (DPB)
300
Хранение компонентов набора: ферменты и буферы набора Transposase-based Barcode Kit необходимо хранить при -20 °С. DNA Purifying Beads (DPB) набора могут храниться при температуре от +4 °C до +8 °C.
Набор используется для создания библиотек на платформе PolySeq, включает в себя все реактивы для пробоподготоки и непосредственно нанопорового секвенирования. Подготовка библиотек с применением данного набора включает два этапа: в первом идет репарация концов и достройка к ним dA-хвостов, во втором — лигирование адаптера секвенирования. Набор рассчитан на 6 реакций.
Особенности набора
Подготовка одной библиотеки за один запуск;
в качестве входящего материала можно использовать очищенные ПЦР продукты, фрагментированную геномную ДНК (например, ДНК, фрагментированная ферментативным расщеплением или ДНК-фрагменты, полученные механическими методами);
требуемое исходное количество ДНК — 1 мкг высокомолекулярной геномной ДНК или ДНК-фрагментов, или от 0,2 — 1 мкг ПЦР продукта;
подготовка библиотеки занимает 2 часа практического времени.
Состав набора
Компонент
Объем компонента, мкл
DNA End-repair Buffer (DEB)
42
DNA End-repair Enzyme (DEM)
18
Ligation Adapter (LA)
30
Ligation Buffer (LB)
150
DNA Ligase (TDL)
50
DNA Purifying Beads (DPB)
1200
All fragment Washing Buffer (AWB)
1800
Long fragment Washing Buffer (LWB)
1800
Elution Buffer (EB)
500
Sequencing Buffer (SQB)
1800
Anchoring Tether (ACT)
60
DNA Positive Control （100 ng/uL） (DPC)
6
Условия хранение: ферменты и буферы набора Universal Library Prep Kit необходимо хранить при -20 °C. DNA Purifying Beads (DPB) набора могут храниться при температуре от +4 °C до +8 °C.
Набор предназначен для прямого секвенирования РНК без стадии обратной транскрипции. С помощью набора Direct RNA Sequencing Kit можно:
изучать модифицированные нуклеотиды и другие характеристики нативной РНК;
секвенировать молекулы РНК, которые плохо подвергаются обратной транскрипции.
Особенности набора
время пробоподготовки
от 115 минут
требуемое количество ДНК
500 нг поли-А+ РНК
необходимость ПЦР
нет
обратная транскрипция
опциональная
длина рида
зависит от длины исходных фрагментов
производительность
до 1 гигабазы за 6 часов, 1-4 гигабазы за 48 часов
совместимые протоколы
Direct RNA Sequencing;
Sequence-specific direct RNA sequencing*
мультиплексирование
на стадии разработки
количество библиотек
6
совместимость с проточными ячейками
FLO-MIN106D; FLO-MIN107
* Полные протоколы доступны на сайте
www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.
Набор предназначен для работы с молекулами РНК, обладающими 3’-концевыми полиА –структурами — эукариотическими мРНК, полиаденилированными вирусными РНК или РНК, обработанными наборами для полиаденилирования. Для РНК без полиА-концов можно синтезировать пользовательские адаптеры, комплементарные 3’-концам (например, для тРНК или 16S-РНК).
В отличие от протоколов секвенирования кДНК, в случае использования набора Direct RNA Sequencing Kit происходит секвенирование нативных молекул РНК; только они проходят через поры проточной ячейки.
Стадия обратной транскрипции при пробоподготовке опциональна, но настоятельно рекомендуется — это повышает производительность секвенирования.
Набор Direct RNA Sequencing Kit незаменим в случае анализа модифицированных нуклеотидов. Если задача выявления таких нуклеотидов не ставится, рекомендуются наборы для секвенирования кДНК, так как они обеспечивают более высокую производительность.
Дополнительные расходные материалы и реактивы:
магнитные частицы Agencourt RNAClean XP (Beckman Coulter);
обратная транскриптаза SuperScript III (Thermo Fisher Scientific, 18080044);
ДНК-лигаза T4 в концентрации 2000 ед/мкл (New England Biolabs М0202);
лигазный буфер NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (New England Biolabs B6058);
10 мМ раствор dNTP (Thermo Fisher Scientific R0192);
1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 0030108051);
0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C);
вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher ScientificR0581);
свежеприготовленный 70% этанол.
Дополнительное оборудование:
настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf3120000062);
наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
термоконтейнер со льдом;
таймер (например, TR118OS);
флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227).
Опционально:
система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
S100 — это настольный секвенатор, отличающийся компактным размером, интуитивно понятным управлением, высокой точностью секвенирования, гибкостью адаптации к различным сценариям и широким спектром выполняемых задач. Единственный прибор для массового параллельного секвенирования, в котором внедрен алгоритм коррекции ошибок (Error Correction Code), что позволяет повысить точность секвенирования в 10 раз.
Генерации кластеров ДНК и секвенирование осуществляются в одном приборе, без выполнения ручных операций. Два режима секвенирования: сверхбыстрый (BitSeq), подходящий для определения количественной структуры цепи (делеции, дупликации, небольшие CNV) и сверхточный (ECC), подходящий и для детекции низкочастотных вариантов.
Для удобства управления системой имеется встроенный сенсорный экран. Секвенатор также имеет полный набор программного обеспечения (с возможностью обновления) для управления системой и первичной обработки данных и встроенный аппаратный модуль для ускорения вычислений.
Ниже вы можете задать вопрос или оставить запрос в свободной форме:
Файлы cookie
Ознакомьтесь с Политикой конфиденциальности, чтобы узнать больше о том, что такое cookies, а так же как и зачем мы используем их. Закрывая данное окно, вы отказываетесь от всех cookies.
Теперь с помощью мобильного телефона легко искать интересующее Вас оборудование,
реактивы и расходные материалы, проверять наличие на складе, сделать заказ
и отслеживать его выполнение!
Подпишитесь на канал Telegram Диаэм
Будьте в курсе последних новостей науки, технологий и интересных предложений!
Актуальные новости из мира Life sciences, биотехнологий и аналитической химии
стали еще доступнее.
Регистрация на сайте компании Диаэм доступна только для юридических лиц, для физических лиц сделать заказ и узнать его статус можно без регистрации или обратившись в компанию по телефону +7 495-745-0508 или электронной почте info@dia-m.ru
