Анализ микотоксинов и аминокислот, содержащихся в пищевых продуктах и сырье, при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Для контроля качества и безопасности сырья и готовой пищевой продукции часто требуется анализировать содержание микотоксинов, а также аминокислотный состав.

Микотоксины

Микотоксины – это вторичные метаболиты микроскопических (плесневых) грибов, которые обитают на многих сельскохозяйственных культурах. Микотоксины являются токсичными соединениями, способными вызывать острые отравления человека и животных, включая летальные исходы. При систематическом приеме корма, зараженного микотоксинами, у животных развиваются хронические заболевания, снижающие их продуктивность и репродуктивный потенциал (вплоть до стерильности). Издержки, связанные с лечением и заменой выбывших животных, снижают экономический эффект сельскохозяйственного производства.

Описаны сотни микотоксинов различной степени токсичности. Наиболее опасными и хорошо изученными являются: афлатоксины (B1, B2, G1, G2, M1, M2), охратоксин А, фумонизины (B1, B2), трихотецены (Т-2, НТ-2, дезоксиниваленол), зеараленон, монилиформин. Концентрации большинства перечисленных микотоксинов в сырье, кормах и пищевых продуктах контролируются в России и странах ЕАЭС. Например, предельно допустимые концентрации (ПДК) указаны в Технических регламентах Таможенного союза (ТР ТС): ТР ТС 015/2011 «О безопасности зерна», ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции», ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции» и пр.

Aflatoxin B1	Aflatoxin G1	Aflatoxin M1
Aflatoxin B2	Aflatoxin G2	Aflatoxin M2

Структурные формулы афлатоксинов B1, B2, G1, G2, M1, M2

Обнаружение микотоксинов

Самым точным методом для выявления микотоксинов в зерне и продуктах питания является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Комплектация и параметры хроматографических систем подбираются исходя из конкретного анализируемого микотоксина. В качестве примера рассмотрим количественное выявление афлатоксинов при помощи ВЭЖХ.

Афлатоксины продуцируются грибами рода Aspergillus, в основном видами Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus. Данные грибы загрязняют афлатоксинами до четверти всех посевов в мире. Эти метаболиты устойчивы в окружающей среде, в том числе термостабильны и не разрушаются после пастеризации. Наиболее опасен афлатоксин В1, который относится к канцерогенам первой группы. Его обнаруживают, например, в зерне, арахисе, фисташках, семенах хлопчатника, сушеных фруктах и прочих переработанных продуктах. Афлатоксины B2, G1, G2 встречаются наряду с В1, но в гораздо меньших концентрациях. При употреблении коровами в пищу зараженных кормов, в их организме афлатоксины B1 и B2 метаболизируются в афлатоксины M1 и M2, которые накапливаются в коровьем молоке и представляют опасность для употребляющих молочные продукты, особенно для детей.

Фотохимическая активация (гидроксилирование) афлатоксина В1

Колонка: SinoPak BEH T-C18 5 µm, 4,6 mm × 250 mm Подвижная фаза: метанол / ацетонитрил / вода = 29 / 17 / 54 (V/V/V) Поток: 1,2 мл/мин Детектор: длина волны возбуждение 333 нм, длина волны излучения 460 нм Объем пробы: 10 мкл Температура колонки: 40 °С № Соединение Время удержания Число тарелок [N/m] Размытие Разделение 1 Aflatoxin G2 6,284 15860 1,02 / 2 Aflatoxin G1 7,19 18224 1,05 2,20 3 Aflatoxin B2 8,02 21376 1,10 1,92 4 Aflatoxin B1 9,375 24716 1,11 2,96

Для выявления афлатоксинов применяют флуоресцентную детекцию. Однако у афлатоксинов B1 и G1 слишком низкий уровень флуоресценции. При облучении смеси афлатоксинов ультрафиолетовым светом (УФ) с длиной волны 254 нм афлатоксины B1 и G1 подвергаются фотоиндуцированному гидроксилированию, после чего их концентрации могут быть определены с помощью флуоресцентной спектрометрии. Таким образом, хроматографическая система требует постколоночной дериватизации.

Система ВЭЖХ для определения микотоксинов

В качестве примера приводим конфигурацию системы ВЭЖХ EClassical 3200 китайской компании Dalian Elite Analytical Instruments для выявления афлатоксинов:

• Поддон для эллюентов T3200.
• Бинарный насос постоянного расхода высокого давления P3220, 70 МПа.
• Автосамплер S3210.
• Флуоресцентный детектор D3250.
• Колоночный термостат O3220L, комнатная температура + 5°C – 85°C.
• Хроматографическая колонка SinoPak C18, 5 мкм, ID 4,6 x 150 мм.
• Модуль фотохимической дериватизации PD3110.
• Двухканальный дегазатор DG3100.
• ПО Kromstation.

Обнаружение аминокислот

Аминокислотный состав продуктов очень важен для понимания пищевой ценности, соблюдения диетических рекомендаций, составления правильных рационов питания животных и пр. Аминокислоты – это одни из самых сложных объектов для анализа при помощи ВЭЖХ из-за их разнообразия, сложной структуры и отсутствия реакции на УФ- и флуоресцентное облучение.

Анализ аминокислот выполняется в два этапа. Первым является гидролиз аминокислот. Обычно предпочтительным методом является кислотный гидролиз. Второй этап – это предколоночная дериватизация, разделение и детекция продуктов реакции. Для дериватизации используются различные химические реагенты. Наиболее популярные: 1-фтор-2,4-динитробензол (DNFB), ортофталевый альдегид (ОРА), 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбамат (AQC). Последний реагент обращает на себя особое внимание, поскольку имеет ряд преимуществ перед аналогами. Так, AQC – это высоко активное соединение, взаимодействующее с аминокислотами с образованием стабильных производных мочевины, которые легко поддается анализу при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ. Первичные и вторичные аминокислоты быстро дериватизируются и остаются стабильны более семи дней при комнатной температуре. При использовании других реагентов, например, OPA, некоторые аминокислоты стабильны всего несколько минут. Еще одной сильной стороной AQC является то, что его дериваты обнаруживаются при помощи УФ-детекции. Это, например, позволяет с высокой чувствительностью количественно определять триптофан, который не выявляется при флуоресцентном обнаружении аддуктов ОРА.

Система ВЭЖХ для определения аминокислот

Один из вариантов конфигурации системы ВЭЖХ EClassical 3200 для детекции аминокислот включает в себя:

• Поддон для эллюентов T3200.
• Четырехканальный градиентный насос P3230, смешивание на стороне низкого давления, 63 МПа.
• Автосамплер S3210.
• Диодно-матричный (512) детектор D3230.
• Колоночный термостат O3220L, комнатная температура + 5°C – 85°C.
• Хроматографическая колонка Supersil ODS2, 5 мкм, ID 4,6 x 250 мм.
• Защитная колонка Supersil ODS2, ODS2, 5 мкм, ID 4,6 x 10 мм.
• Двухканальный дегазатор DG3100.
• ПО Kromstation.

Схема взаимодействия 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбамата (AQC) с первичной либо вторичной аминокислотой с образованием деривата аминокислоты	Хроматограмма разделения аминокислот молока

Обращаем ваше внимание, что приведенные конфигурации EClassical 3200 для детекции микотоксинов и аминокислот носят предварительный характер. Детальный список необходимого оборудования сотрудники Диаэм составят исходя из конкретных условий и потребностей пользователя (анализируемые объекты, планируемые к использованию методы, реактивы и пр.).

Информация для заказа: